共沉淀法是什么|原理圖（共沉淀法的優(yōu)缺點及方法有哪些）
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添加時間：2022-11-23 瀏覽次數(shù):1766
生物個體的許多生命活動過程都與蛋白質(zhì)相互作用有密切的聯(lián)系，因此隨著生命科學(xué)研究的不斷深入，研究蛋白質(zhì)相互作用成為了揭示各種生命活動機制的必要步驟。迄今已經(jīng)發(fā)展出了多種用于研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)和方法，例如免疫共沉淀，酵母雙雜交技術(shù)，雙分子熒光互補技術(shù)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)和串聯(lián)親和純化聯(lián)合質(zhì)譜分析的方法等。
Co-IP是一種基于抗原與抗體的專一性結(jié)合的實驗方法，廣泛應(yīng)用于檢測生理條件下蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。這種方法常用于鑒定兩種目標蛋白質(zhì)是否存在相互作用，也可以用于確定某種已知蛋白質(zhì)和其他未知蛋白質(zhì)之間的相互作用。
Co-IP的基本原理：首先在非變性條件下使用溫和的細胞裂解液裂解細胞，此時存在于完整細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用被保留了下來。隨后向細胞裂解液中加入偶聯(lián)某種抗體的瓊脂糖珠并進行孵育。當?shù)鞍踪|(zhì)A被其抗體特異識別并結(jié)合后，A可以與其抗體免疫沉淀，那么在細胞內(nèi)與A存在相互作用的蛋白質(zhì)或者蛋白復(fù)合物B也能沉淀下來。利用洗脫液洗脫沉淀下來的蛋白，通過Western blotting對這些蛋白進行鑒定和分析。
實驗方法
收集已同時表達蛋白X和蛋白Y的細胞。
吸凈細胞培養(yǎng)液，用PBS小心漂洗一次，然后加入500μl預(yù)冷的Lysis/IP buffer，于冰上放置15 min，每隔幾分鐘晃動一次。
將細胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管內(nèi)，于4℃，13,000 rpm離心5 min。
將離心后的上清留取少量樣品后（所留樣品加入等體積的2×蛋白上樣緩沖液，混合后，于100℃煮沸5 min，離心后放置-20℃保存?zhèn)溆茫?，對蛋白含量進行定量，補充Lysis/IP buffer至1 ml左右，然后分別加入50μl 50％的Progein G beads，于4℃環(huán)境下，將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉(zhuǎn)1 h以除去Protein G beads非特異結(jié)合的蛋白。
于4℃，13,000 rpm離心5 min，將上清液再次轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管內(nèi)，加入1μl的正常小鼠IgG或者是FLAG單克隆抗體，于4℃環(huán)境下，將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉(zhuǎn)1 h，使抗體與蛋白進行特異結(jié)合。
加入50μl 50％的Protein G beads，于4℃環(huán)境下，將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉(zhuǎn)1 h，使Protein G beads與抗體結(jié)合。
于4℃，13,000 rpm離心5 min，棄上清，然后用Lysis/IP buffer洗滌三次，每次都在4℃環(huán)境下，將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉(zhuǎn)15 min。
最后一次洗滌完畢，棄上清，管中只剩下beads，加入25μl的2×蛋白上樣緩沖液，混合后，于100℃煮沸5 min，離心后即可上樣SDS-PAGE膠或者放置-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>
注意事項
細胞裂解要采用溫和的裂解條件，避免破壞細胞內(nèi)存在的蛋白間相互作用，裂解、洗滌時需使用非變性裂解液，如NP-40和Triton X-100。
由于不同細胞裂解條件不一樣，建議通過預(yù)實驗來確定最佳條件。
抗體的選擇十分重要，選經(jīng)過IP驗證的抗體，可以減少假陽性概率。
注意抗體/緩沖液的比例，抗體稀釋過度不利于后續(xù)抗原抗體結(jié)合；而抗體過多就不能完全沉降在固相基質(zhì)上，殘存于上清。
操作時，為了避免損傷beads，使用大口徑或截短槍頭進行加樣。
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